离交换层析(Ion Exchange Chromatography简称IEC)离交换剂固定相依据流相组离与交换剂平衡离进行逆交换结合力差别进行离种层析1848Thompson等研究土壤碱性物质交换程发现离交换现象本世纪40代现具稳定交换特性聚苯乙烯离交换树脂50代离交换层析进入物化领域应用于氨基酸析目前离交换层析仍物化领域用种层析广泛应用于各种化物质氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等离纯化用离交换剂:离交换纤维素、离交换葡聚糖离交换树脂离交换层析基质由带电荷树脂或纤维素组带电荷称阴离交换树脂;带负电荷称阳离树脂离交换层析同用于蛋白质离纯化由于蛋白质等电点蛋白质处于同pH条件其带电状况同阴离交换基质结合带负电荷蛋白质所类蛋白质留柱通提高洗脱液盐浓度等措施吸附柱蛋白质洗脱结合较弱蛋白质首先洗脱反阳离交换基质结合带电荷蛋白质结合蛋白通逐步增加洗脱液盐浓度或提高洗脱液pH值洗脱

⒈离交换剂预处理装柱于离交换纤维素要用流水洗少量碎易沉淀颗粒保证较均匀度于已溶胀产品则必经步骤溶胀交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理使带H+或OH-交换剂型阴离交换剂用碱-酸-碱处理使终转-OH-型或盐型交换剂;于阳离交换剂则用酸-碱-酸处理使终转-H-型交换剂洗涤纤维素使用前必须平衡至所需pH离强度已平衡交换剂装柱前要减压除气泡避免颗粒等交换剂自沉降层要适加压装柱同使柱床压紧减少死体积利于辨率提高柱装再用起始缓冲液淋洗直至达充平衡使用

⒉加与洗脱加:层析所用品应与起始缓冲液相同pH离强度所选定pH值应落交换剂与结合物相反电荷范围同要注意离强度应低用透析、凝胶滤或稀释达目品溶物应透析或凝胶滤前离除达满意离效量要适要超柱负荷能力柱负荷能力用交换容量推算通量交换剂交换总量1%-5%洗脱:已结合品离交换前通改变溶液pH或改变离强度结合物洗脱同改变pH与离强度使复杂组份离完全往往需要逐步改变pH或离强度其简单阶段洗脱即同pH与离强度溶液加入使同逐步洗脱由于种洗脱pH与离强度变化使许洗脱体积相近同洗脱纯度较差适宜精细离洗脱连续梯度洗脱洗脱装置见图16-6.两容器放于同水平第容器盛定pH缓冲液第二容器含高盐浓度或同pH缓冲液两容器连通第容器与柱相连溶液由第容器流入柱第二容器溶液自补充经搅拌与第容器溶液相混合流入柱缓冲液洗脱能力即梯度变化第容器任何间浓度都用式进行计算:C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1式A1、A2别代表两容器截面积:C1、C2别表示容器溶液浓度;V流体积总体积比A1=A2线性梯度A1＞A2凹形梯度A1＞A2凸形梯度洗脱应满足要求:①洗脱液体积应足够般要几十倍于床体积使离各峰致于太拥挤②梯度限要足够高使紧密吸附物质能洗脱③梯度要升太快要恰使移区带快柱末端达解吸状态目物早解吸引起区带扩散;目物晚解吸使峰形宽

⒊洗脱馏份析按定体积(5-10ml/管)收集洗脱液逐管进行测定层析图谱依实验目同采用适宜检测(物性测定、免疫测定等)确定图谱目物位置并收目物

⒋离交换剂再与保存离交换剂柱再离交换纤维素用2mol/:NaCl淋洗柱若强吸附物则用0.1mol/LNaOH洗柱;若脂溶性物质则用非离型污剂洗柱再用乙醇洗涤其顺序:0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水保存离交换剂要加防腐剂阴离交换剂宜用0.002%氯已定(洗必泰)阳离交换剂用乙基硫柳汞(0.005%)些产品建立用0.02%叠氮钠

⒌离交换层析应用离交换层析技术已广泛用于各科领域物化及临床化检验主要用于离氨基酸、肽及蛋白质用于离核酸、核苷酸及其带电荷物

概念

层析色层析简称利用各组物理性质同组混合物进行离及测定吸附层析、配层析两种般用于机化合物、金属离、氨基酸等析层析(chromatography)利用物质固定相与流相间同配比例达离目技术层析物蛋白质核酸等复杂机物混合物离析极高辨力

[编辑本段]语源

chrome意色彩graphy源自希腊文意写色谱层析同义语都英语chromatography译

层析(色谱) chromatograpby

微细散固体或附着于固体表面液体作固定相液体(与述液体相混合)或气体作移相系统使试料混合物各边保持向两相布平衡状态边移利用各固定相亲力同所引起移速度差彼离定性与定量析称层析亦称色谱根据移相种类同液体层析、气体层析二种用作固定相矽胶、性炭、氧化铝、离交换树脂、离交换纤维等或硅藻土纤维素性载体附着适液体使用其物质作固定相微细粉末状物质装入细形圆筒进行层析称柱层析(column chromatogra-phy)玻璃板涂层薄均物质作固定相称薄层层析(thin-layer chromatography)者与用滤纸作固定相纸层析进行同析即固定相端点微量试料密闭容器使移相(液体)端渗入移接近另端通种展操作各呈斑点状移各自位置再根据Rf值测定进行鉴定斑点易肉眼观察利用适显色剂或通紫外灯产荧光进行观察采用第种移相展再用另移相进行展(展向应与原向垂直)使各离完全双相层析(two-dimensional chromatography)离斑点位置固定相切取其含自试料物质提取进行定量析制备与定量柱层析则更适宜柱层析移相加入试料端展达另端继续展使各移相起向柱外别溶广泛使用所谓洗提层析(elution chromatography)层析根据固定相与溶质(试料)间亲力差异吸附型、配型、离交换型(离交换层析)等三种类型并严格见其间类型外近应用亲层析即与基质类似化合物(通共价键)结合固定相再利用其特异亲性沉淀与其应特定酶或蛋白质

[编辑本段]类别

◆按层析机理划:

吸附层析、配层析、离交换层析、凝胶滤层析、亲层析等

吸附层析:利用吸附剂表面同组吸附性能差异达离鉴定目

配层析:利用同组流相固定相间配系数同使离

离交换层析:利用同组离交换剂亲力同

凝胶层析:利用某些凝胶于同组阻滞作用同

◆按流相与固定相同划:

气相层析、液相层析两类层析流相同划同区流相固定相划:气固层析、气液层析、液固层析液液层析等

◆按操作形式划:

柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等

柱层析:固定相装于柱内使品沿向移达离

纸层析:用滤纸做液体载体点用流相展达离鉴定目

薄层层析:适粒度吸附剂铺薄层纸层析类似进行物质离鉴定

划严格界限些名称相互交叉亲层析应属于种特殊吸附层析纸层析种配层析柱层析做各种层析

[编辑本段]基本原理

层析须两相系统间进行相固定相需支持物固体或液体另相流相液体或气体流相流经固定相离物质两相间配由平衡状态失平衡恢复平衡即断经历吸附解吸程随着流相断向前流离物质间现向前移速率差异由始单区带逐渐离许区带程叫展层

系数K物质两相浓度比K值则固定相吸附牢K值吸附差各物质间K值差别则易离同类型层析K值含义同视吸附平衡数配数或离交换数等

研究层析现象发展塔板理论与机化实验馏原理些相似馏机溶剂馏柱内填充物形许热交换层低沸点溶剂先馏达纯化目层析用理论塔板数n衡量层析效能

tR物质层析柱保留间W洗脱物质峰形宽度n值愈表示层析柱效能愈高用理论塔板高度H表示则包含层析柱度

式L层析柱柱H值越则柱效越低

外影响层析离效涡流扩散、纵向扩散传质阻抗等素选择层析固定相支持物粒度、均匀度等物理性能流相层析系统温度等都做层析关键

[编辑本段]几种用层析

◆吸附层析

吸附剂吸附力强弱由能否效接受或供给电或提供接受泼氢决定吸附物化结构与吸附剂相似电特性吸附更牢固用吸附剂吸附力强弱顺序:性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉糖等性炭吸附力强吸附剂使用前须先用加热脱水等化数吸附剂遇水即钝化吸附层析用于能溶于机溶剂机化合物离较少用于机化合物洗脱溶剂解析能力强弱顺序:醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳烷等能较离效用两种或数种同强度溶剂按定比例混合合适洗脱能力溶剂系统获佳离效

◆配层析

支持物形部互溶两相系统般水相机溶剂相用支持物硅胶、纤维素淀粉等些亲水物质能储留相量水离物质两相都能溶解配比率同展层形同速度向前移区带

◆离交换层析

支持物工交联带能解离基团机高离交换树脂、离交换纤维素、离交换凝胶等带阳离基团磺酸基(-SO3H)、羧甲基(-CH2COOH)磷酸基等阳离交换剂带阴离基团DEAE-(二乙基胺乙基)QAE-(四级胺乙基)等阴离交换剂离交换层析适用于能水解离化合物包括机物机物于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸离析极辨力离交换基团水溶液解离能吸引水离物离各种物质离交换剂离浓度与周围溶液离浓度保持平衡状态各种离同交换数K值愈高吸附愈牢洗脱增加溶液离强度改变pH增加盐浓度离取代解吸洗脱程按K值同同区带

◆凝胶滤层析

支持物工合交联高聚物水膨胀凝胶凝胶内内水层凝胶周围水外水层控制交联度形同孔径网状结构交联度孔径交联度孔径凝胶允许离物质于孔径进入于孔径排斥外水层先洗脱进入孔径按量致离同区带选择同规格凝胶混合物按量差异同组种曾称筛目前用凝胶商品:葡聚糖凝胶(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(bio-gel)、琼脂糖凝胶(sepharose)聚苯乙烯凝胶(styragel)等

◆亲层析

专相互作用物质其联结支持物用于纯化相另物质见亲:酶抑制剂抗原抗体激素受体等支持物琼脂糖或纤维素等

◆气相层析

属于配层析或吸附层析仅适用于析离挥发性低挥发性物质固定相惰性支持物(磨细耐火砖)覆盖层高沸点液体硅油、高沸点石蜡油脂、环氧类聚合物外涂层约支持物重量20%析操作温度范围般室温200℃特殊层析柱能达500℃流相用氦、氩或氮展层气体气相层析离区带十清晰由于挥发性物质两相间能快达平衡所需析间缩短般数钟至10余钟检测记录系统绘各峰测定流气体电阻变化结测定品量微克毫微克水平具快速、灵敏微量优点气相层析能用于离制备品需增加流气体通冷冻离物收装置

◆纸层析

滤纸支持物配层析组滤纸纤维素亲水物质能形水相展层溶剂两相系统离物质两相配保持平衡关系纸层析用于析简单混合物做单向层析于复杂混合物做双向层析1944A.J.P.马丁第用纸层析析氨基酸离效创近代层析发展应用新局面70代纸层析已逐渐其辨力更高、速度更快更微量化新离交换层析、薄层层析、高效液相层析等所代替

◆薄层层析

玻璃片、金属箔或塑料片铺层约1~2毫米支持物纤维素、硅胶、离交换剂、氧化铝或聚酰胺等根据需要做同类型层析聚酰胺薄膜种特异薄层尼龙溶解于浓甲酸涂涤纶片基甲酸挥发涤纶片基形层孔薄膜其辨力超用尼龙粉铺薄层薄层层析较纸层析优越于辨高展层间短例用纸层析做氨基酸析往往需要两间且层析条件要求严格易满意离效用薄层层析做般约需半离效更薄层层析般用于定性析能用于定量析制备品

◆高效液相层析(名高压液相色谱)

70代新发展层析其特点:用高压输液泵压强高达5000psi(相于34标准气压)用直径约3~10微米超细支持物装填均匀锈钢柱用支持物玻璃珠涂层1~2微米二氧化硅经硫酰氯反应Si-Cl进步连接疏水烷基Si-C18H37或阳离交换基团-Si(CH2)n-C6H4SO3H或阴离交换基团-Si(CH2)nNH2种支持物能承受高压力化性能稳定用同类型支持物HPLC做吸附层析、离交换层析凝胶滤层析其析微量化达10-10克水平用于制备纯化克品展层间短般需几钟10余钟其析速度、精确度与气相层析媲美HPLC适于析离挥发极性物质气相层析适用于挥发性物质两者互补充都目前理想层析HPLC配程序控制洗脱溶剂梯度混合仪数据处理积仪记录仪等电系统

种先进析仪器物化、化、医药环境科研究发挥重要作用

◆反相层析

吸附层析高极性物质层析柱吸附较牢洗脱发拖尾现象保留间问题支持物涂层高碳原疏水性强烷烃类洗脱液用极性强溶剂甲醇水混合物则离品极性强物质吸附先洗较离效种层析与普通吸附层析相反故称反相层析目前用HPLC做反相层析用ODS柱即支持物表面连接C18H37Si-基团

◆同系层析

核酸析品经核酸酶部裂解同度核苷酸片段用同位素标记DEAE纤维素薄层离用含未标记相同核苷酸片段作展层溶剂未标记核苷酸标记核苷酸推进使按量同标记核苷酸片段按由序排列达离目于种层析称同系层析同系层析电泳相结合曾用于寡核苷酸顺序析

纸层析层析种,要解纸层层析始.层析称色层析或色谱(Chromatography)种基于离物质物理、化及物特性同使某种基质移速度同进行离析例:我利用物质溶解度、吸附能力、立体化特性及、带电情况及离交换、亲力及特异物反应等面差异使其流相与固定相间配系数(或称配数)同达彼离目

层析特点离效率高能离各种性质极相类似物质且既用于少量物质析鉴定用于量物质离纯化制备作种重要析离手段与广泛应用于科研究与工业产现石油、化工、医药卫、物科、环境科、农业科等领域都发挥着十重要作用层析根据固定相基质形式类层析纸层析、薄层层析柱层析其纸层析指滤纸作基质层析